用于创伤性脑损伤的体内早期实时诊断的 可激活 NIR-II 纳米探针

摘要：创伤性脑损伤(TBI)是最危险的急性疾病之一，发病率和死亡率都很 高。目前的方法在早期诊断和病理过程的实时反馈方面仍然有限。在此，提出了 一种第二近红外窗口(NIR-II)中的靶向可激活荧光纳米探针(V&A@Ag2S)用于 TBI 的体内光学成像。最初，由于能量从 Ag2S 转移到 A1094 发色团，V&A@Ag2S 的荧 光被关闭。静脉注射后，V&A@Ag2S 基于 VCAM1 介导的内吞作用在 TBI 发炎的血管 内皮中迅速积累，之后，由于被 TBI 前驱生物标志物过氧亚硝酸盐(ONOO -)漂白 A1094，纳米探针实现了 Ag2S 量子点(QD)NIR-II 荧光的快速恢复。纳米探针对 ONOO -具有高特异性、快速响应和高灵敏度，为 TBI 的体内早期实时评估提供了 一种方便的方法。 正文：创伤性脑损伤(TBI)是导致人类（尤其是年轻人）死亡和残疾的重要 原因，全球每年有超过 5000 万新的 TBI 病例发生。除了源自机械损伤的原发损 伤外，TBI 引起的继发性损伤包括炎症、血脑屏障(BBB)破坏、氧化应激、缺氧 和缺血可导致一系列连锁损伤，并最终导致不可逆的损伤-功能丧失或死亡。由 于这些过程通常是隐蔽的，实现早期实时诊断和有效干预的方法对于 TBI 治疗的 成功至关重要。然而，方法上的挑战依然存在。具体而言，计算机断层扫描(CT) 和磁共振成像(MRI)常被用作 TBI 诊断的体内成像方式，主要检测器官的解剖和 功能变化（脑水肿和出血），这些在检测 TBI 早期分子水平变化方面效用不大。 虽然 BBB 生物标志物（GFAP 和 UCH-L1）和脑脊髓液（乙酰胆碱）也被用作评估 TBI 体外诊断方法。此类分析提供的静态分析，有限样本无法提供 TBI 进展的完 整概况。因此，迫切需要开发具有高灵敏度的新方法来实现原位早期实时 TBI 诊断和治疗评估。 荧光成像技术具有快速反馈、多信号采集、灵敏度高、无电离辐射等固有特 性，是实时监测生物体疾病发生和发展的一种特别有利的方法。具体而言，第二 个近红外窗口（NIR-II，1000-1700nm）中的荧光成像引起了很多关注，因为它 提供了无与伦比的组织穿透（几厘米）和空间分辨率（约 10μm），因为它的最 小光子吸收和散射以及可忽略的组织自发荧光；这些特性有望使其成为首选的下 一代活体成像技术。虽然一系列 NIR-II 荧光探针包括单壁碳纳米管(SWCNT)、量 子点(QD)、稀土掺杂纳米粒子(RENP)、和有机染料已经开发用于体内各种生物医 学应用，使用这种尖端技术的 TBI 实时体内可视化尚未得到证实。早期生物标志 物的鉴定和相关分子探针的开发对于 TBI 的早期诊断至关重要。以往的研究已经 证实，基于生化应激反应，活性氧（ROS）和活性氮（RNS）与 TBI 的进展密切相 关。特别是，源自脑血管系统的过氧亚硝酸盐(ONOO -)有助于 TBI 的显着进展， 使其成为 TBI 的前驱生物标志物。 在此，我们报告了一种新型靶向可激活 NIR-II 纳米探针（V&A@Ag2S）的设 计和合成，用于 TBI 早期生物标志物的实时体内成像。如方案 1 所示，V&A@Ag2S 主要包括三个成分：VCAM1 结合肽(VHPKQHR)、NIR 吸收剂 A1094 和 Ag2S QD，其 中使用在 1050nm 处发射的 Ag2S QD 作为能量供体，ONOO -响应 A1094 发色团用作 能量受体。由于 A1094 的吸收光谱和 Ag2S QD 的发射光谱之间存在大量重叠，因 此在没有 ONOO -的情况下，V&A@Ag2S 通过从 Ag2S QD 到 A1094 的高效能量转移保 持在“关闭”状态。相反，在 ONOO -存在下，A1094 被氧化，1094nm 处的吸收峰 消失；因此，Ag2S QD 被“打开”并在 1050nm 处诱导荧光信号显着升高。此外， VCAM1 结合肽络合物使纳米探针能够对 TBI 发炎内皮区域表达 VCAM1 的高靶向能 力。这种可激活的探针提供了一系列显着特征：1)A1094 和 ONOO 之间的高化学 反应动力学为这种半衰期短的生物分析物提供精确有效的体内检测，2)与“始终 开启”探针相比，关-开策略大大降低了背景噪音，从而实现了高信噪比(SNR) 并产生高灵敏度的快速诊断。3)它在成像剂量下表现出高胶体和光学稳定性以及 低细胞毒性。所有这些优点使这种新型靶向可激活 NIR-II 纳米探针具有未来临 床应用的潜力。 V&A@Ag2S 的典型合成包括三个主要步骤。首先，按照我们之前的方法制备了 疏水性 1-十二烷硫醇(DT)-Ag2S 量子点。A1094 是根据 Tian 报告的方法合成的， 并进行了修改（支持信息的图 S1-S4；有关详细信息，请参见实验部分）。其次， 通过 VCAM1 结合肽修饰的 DSPE-mPEG、十二烷基磺酸钠(SDS)和 DT-Ag2S 量子点的 可行自组装获得 VHPK-Ag2S。第三，将 A1094 分子加入到 VHPK-Ag2S 中，导致 V&A@Ag2S 处于关闭状态.值得注意的是，将 SDS 引入该系统通过季铵盐和磺酸盐 基团之间的强离子键确保了 A1094 固定在 Ag2S QD 的表面上。 A1094 在 1 毫克每毫升 Ag2S 量子点中最佳负荷浓度为 490μm，这导致 Ag2S 量子点良好的荧光猝灭效应（约 96.3％）。图 S6 中的透射电子显微镜(TEM)图像 说明了所制备的 V&A@Ag2S 纳米探针的高度均匀性，其平均核心尺寸为直径约 3.3nm 的 Ag2S 量子点。用动态光散射(DLS)测量 V&A@Ag2S 纳米探针在水溶液中的 流体动力学直径(HD)为 39.4nm。在阳离子 VHPK 肽表面附着后，纳米探针的 zeta 电位从-52.5mV 增加到-2.8mV。如图 S7 所示，进一步研究了 V&A@Ag2S 的光物理 性质。Ag2S QDs 具有典型的宽带吸收率和清晰的 NIR-II 发射光谱。与 A1094 偶 联后，在 1094nm 处出现强吸收峰，与 Ag2S QDs 的发射有很大重叠，确保了 Ag2S QDs 和 A1094 之间的高效荧光共振能量转移（FRET）。我们还研究了 V&A@Ag2 S 的稳定性，发现它在不同的缓冲溶液（PBS、FBS 和 RPMI 1640）中保持高光学稳 定性（淬灭状态）和胶体稳定性（图 S6 和 S8）。 接下来，我们通过记录探针对各种 ROS/RNS 的反应来检查探针的特异性。令 人鼓舞的是，除了 ONOO -/ClO -之外，没有其他分析物可以激活 V&A@Ag2S 的荧光。 其他主要的生理离子，包括 Na +、K +、Ca 2+、Fe 3+、Zn 2+、Cl -、HCO3−和 HPO4 2−对 V&A@Ag2S 的荧光激活影响可忽略不计，表明 V&A@Ag2S 对 ONOO −具有很大的特异性（图 1a,b) 此外，在 V&A@Ag2S 溶液（50μgmL -1）中添加了范围从 0 到 21μM 的各种浓度的 ONOO -。V＆A@Ag2S 在 1050nm 处的荧光强度与 ONOO -浓度的增加呈线性关系，表明 V＆A@Ag2S 具有量化 ONOO -的巨大潜力（图 1 c，d）。应当指出的是，V＆A@Ag2S 对 ONOO -的动态响应在一秒钟之内完成。（支持信息中的视频 1），证明了这一强 大的 ONOO -在检测工具对其极短半衰期的鲁棒性。鉴于 Ag2S QD 具有化学惰性（图 S9），我们检查了 A1094 与各种 ROS/RNS/离子之间的相互作用，以确定该过程中 涉及的主要因素。首先，制备呈天然紫色的 5A1094 溶液（DMSO/PBS，浓度为 1:99， v/v；pH7.4）。然后，使用一系列 ROS/RNS 离子来检查这些分析物与 A1094 之间 的相互作用。添加 ONOO -或 ClO -到 A1094 触发了显着的颜色变化（从紫色到淡黄 色），如图 S10a 所示。相比之下，其他分析物的颜色变化可以忽略不计。检测加 入不同分析物后 A1094 的吸收光谱。结果与上述报道一致；将 ONOO -或 ClO -添加 到 A1094 中导致 A1094 特征吸收峰在 1094nm 处消失，而 A1094 的典型吸光度在 添加其他分析物后保持相同强度。这种差异可归因于化学结构相关的可变反应动 力学。添加 ONOO -后进一步鉴定 A1094 的氧化产物，最终产品使用 HPLC-MS 进行 分析。潜在机制可归因于 A1094 与 ONOO -的氧化反应，此后共轭结构被破坏，影 响电子转移过程并导致特征 A1094 吸收峰在 1094nm 处消失。 由于 VCAM1 的表达在各种炎症血管疾病的内皮细胞中上调，并且已知 VHPK 肽结合纳米颗粒通过 VCAM1 介导的内吞作用被吸收，因此我们首先确定 V&A@Ag2S 是否可以有效地内化到炎症血管内皮细胞中。由于其处于关闭状态，V&A@Ag2S 被预标记为 Cy7.5（λem=825 nm）（图 S13，详见实验部分）并进一步处理，用于 细胞成像。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用 TNF-α(3ng mL -1 )（一种众所周知的 内皮表面 VCAM1 表达诱导剂）预处理 12 小时，然后与 Cy7.5 修饰的 V&A@Ag2S 进 一步孵育 1 小时，并使用荧光显微镜成像。如图 2a 所示，从 Cy7.5 强烈的荧光 信号可以在 TNF-α处理的 HUVEC 中观察到，而非常弱的荧光在非处理的 HUVEC 看出。这一结果通过量化 Cy7.5 的荧光强度，使用流式细胞仪进一步证实。正如 预期的那样，荧光免疫组织化学测定表明，TNF-α显著增加 VCAM1 表达中，提供 了直接的证据表明，V＆A@Ag2S 可实现通过 VCAM1 依赖的细胞内运输在发炎内皮 细胞中实现有效的内部化。 为了进一步揭示 V&A@Ag2S 的细胞内分布，使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM) 执行荧光共定位成像。用 10μg mL -1 V&A@Ag2S 用 TNF-α处理的 HUVEC 预孵育 1 小时后，细胞进一步用两种典型的细胞器探针 LysoTracker（577/590nm，靶向 溶酶体）和 MitoTracker 染色（490/510nm，靶向线粒体），可分别实现活细胞中 溶酶体和线粒体的特异性成像。如图 3a 、c 所示，借助 Cy7.5 的荧光信号， V&A@Ag2S 的 胞 内 定 位 可 以 很 容 易 地 通 过 共 聚 焦 成 像 探 测 。 有 趣 的 是 ， Cy7.5Pearson 相关系数分析表明 V＆A@Ag2S 主要位于 VCAM1 介导的内吞作用后的 溶酶体中。考虑到溶酶体的酸性，我们还评估了 V&A@Ag2S 和 A1094 的光物理性 质，它们在不同 pH 条件（pH=3-9）下表现出良好的光学稳定性。 在验证了 V&A@Ag2S 在水溶液中检测 ONOO -的能力后，我们接下来研究了其监 测细胞内 ONOO -生成的可行性。为此，使用 3-吗啉酰亚胺(SIN-1)诱导内皮细胞 氧化应激，在体内模拟 TBI 并产生 ONOO -。人脐静脉内皮细胞与 TNF-α在 3ng mL - 浓度下预孵育 12 小时，然后与 V&A@Ag2S（10μgmL -1）进一步孵育另外 1 小时， 然后用或不用 SIN-1（0.5NM）进行刺激。如图 4a 所示，在没有 ONOO -供体 SIN-1 的情况下，经过 V&A@Ag2S 处理的 HUVECs 中没有观察到可检测的 NIR-II 荧光信 号。相反地，在 SIN-1 的存在下，30 分钟内出现剧烈 NIR-II 荧光，表现出时间 依赖性的 NIR-II 荧光信号增强，从而表明纳米探针的荧光快速恢复，并显示其 在体内快速和实时检测 ONOO -的巨大潜力。 对于潜在的生物医学应用，探针的生物毒性是一个主要问题。我们通过标准 抗膜联蛋白 V-FITC 和 PI 双染色评估了 V&A@Ag2S 对 HUVECs(人骨间充质干细胞) 的细胞毒性。随后通过流式细胞术检测小鼠成纤维细胞 L929 细胞的细胞毒性。 在 V&A@Ag2S 浓度为 20–100μg mL -1的情况下，培养 24 小时后细胞存活率估计 分别大于 83%、91%和 95%，表明 V&A@Ag2S 的毒性相对较低。此外，还通过静脉 注射剂量为 2mg kg -1的 V &A@Ag2S 后 24 小时和 7 天的血样，以评估 V&A@Ag2S 的 体内毒性。与对照组相比，血液生化和血液学分析显示指标的波动可以忽略不计， 表明纳米探针的生物相容性高。 受到上面获得的有希望的体外和体内结果的鼓舞，我们进一步评估了所制备 的纳米探针用于体内 ONOO -检测的可行性。为此，采用了 TBI 小鼠模型（详见实 验部分）。通过受控的颅骨钻孔穿刺和 V@Ag2S（VCAM1 结合的 Ag2S QD，“始终开 启”探针）在无胸腺小鼠头部右侧诱发 TBI，并以 Ag2S QD，非靶向探针）作为 对照。静脉注射常开探针 V@Ag2S（Ag2S QD：0.1mg mL -1,200μL)，开始时荧光信 号广泛分布于整个大脑区域。捕获 NIR-II 荧光图像的时间跨度显示荧光信号逐 渐衰减，尽管由于极高的背景噪声导致低信噪比（低于 Rose 标准 SNR≥5），很 难将 TBI 区域与正常脑组织区分开来）。信噪比可以定义为信噪比=[(平均荧光强 度 1)-(平均荧光强度 3)]/[(平均荧光强度 2)-(平均荧光强度 3)]。有趣的是， 可激活的 NIR-II 探针 V&A@Ag2S 允许对 TBI 进行快速和特异性的荧光成像。如图 5 所示，在纳米探针注射后，TBI 小鼠右脑半球立即出现 NIR-II 荧光信号，在任 何其他区域均未发现可检测到的荧光。由于缺乏背景噪音，注射后 10 分钟内具 有优异的靶向组织与正常组织信号比（SNR>10.2），实现了体内快速诊断。此后， 在病变部位稳定观察到荧光信号的进一步增强，表明 V&A@Ag2S 实现了对内源性 RNS 的高灵敏度、实时原位检测。相比之下，在非靶向 A@Ag2S 探针和动物对照（健 康小鼠）组的小鼠大脑半球均未观察到显着信号。这些结果表明基于这种有针对 性的可激活 NIR-II 成像策略，在活小鼠中很容易检测到 ONOO -的动态形成过程。 总之，我们开发了一种可激活的靶向 NIR-II 荧光纳米探针，用于快速灵敏 地检测 ONOO -。A1094 是一种在 NIR-II 区域具有吸光度的 ONOO -敏感染料，它成 功地引入 NIR-II-Ag2S 量子点的表面，使这些纳米探根据 3Sb/k 标准（Sb是十一 次空白重复测定的标准偏差，k 是校准曲线的斜率）。能够实现低至 0.06μMONOO -。 利用 NIR-II-Ag2S 独特的光学特性，我们已经证明了这种纳米探针在 TBI 模型中 用于体内 RNS 检测的可行性。据我们所知，这是第一个用于 TBI 体内成像的基于 FRET 的可激活 NIR-II 纳米探针。该 NIR-II 生物传感系统的成功开发代表了向 体内荧光诊断迈出的重要一步。我们设想第二个近红外窗口中的体内开启传感和 成像策略将在临床实践中开辟荧光成像的巨大潜力。 图示： 方案一：V&A@Ag2S 探针的制备和体内检测 ONOO -的示意图 图三：发炎的内皮细胞的共聚焦荧光图像。a)将细胞与 Cy7.5 修饰的 V&A@Ag2S(10μgmL -1)在 37°C 下孵育 1 小时，然后与 LysoTracker(577/590 nm)、 MitoTracker(490/510nm)和 Hoechst 进一步孵育。b)Cy7.5 和 LysoTracker 的共 定位图像显示了这两个通道之间的大量重叠。插图：89.1%重叠，由 Pearson 相 关分析确定。c)发炎的内皮细胞的三维荧光图像。比例尺=20-μm。 图四：a)TNF-α处理的 HUVEC 与 V&A@Ag2S(10μgmL -1)预孵育 1 小时，然后用 或不用 SIN-1(0.5mmM)进行刺激。b)各种处理后 HUVECs 细胞质中 NIR-II 荧光强 度的时间跨度。比例尺=10μm。 图五：a)注射 V@Ag2S、V&A@Ag2S 和 A@Ag2S 后不同时间点中 NIR-II 荧光的时 间跨度。b)时间依赖性信号转各种处理后小鼠的 NIR-II 荧光成像确定的信噪比 (SNR)变化

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